• گروه علمی آزمایشگاه نیلو

 هر آنچه که باید در مورد تست NIPT بدانیم.

- طبق آخرین توصیه ACOG این تست باید در دسترس تمام زنان بارداری صرف نظر از ریسک پایه (ناشی از سن و یا تست های غربالگری) قرار گیرد.

- طبق آخرین توصیه انجمن متخصصین ژنتیک پزشکی آمریکا (ACMG) این تست برای بررسی اختلالات کروموزومی شایع (تریزومی 21، 18 و 13) و اختلالات کروموزوم های جنسی (سندرم ترنر و یا 45,X، کلاین فلتر و یا 47,XXY ، تریپل ایکس و یا 47,XXX و یا ابر زن و سندرم جاکوبز - 47,XYY) قابل اعتماد است.

- از هر 150 زایمان منجر به تولد زنده (بدون وابستگی به سن)، یک مورد اختلال ژنتیکی دیده می شود که عبارتند از:

- - اختلالات کروموزومی که شامل آنوپلوئیدی ها (حذف و یا اضافه شدن یک کروموزوم بصورت کامل و یا جزئی که چندین ژن را تحت تاثیر قرار می دهد)

- - اختلالات تک ژنی 

- از اوایل دهه 1980 تست های غربالگری بعنوان قسمتی از مراقبت های دوران بارداری (prenatal care) در دسترس قرار گرفت.

- این تست ها جزو مراقبت های کلیدی (key component of prenatal care) دوران بارداری بوده ولی محدودیت هایی دارد از جمله:

- - موارد مثبت غربالگری حتماً باید تایید شود.

- - قطعات DNA منشاء جفت داشته و همیشه بازتابی از قطعات DNA جنین نمی باشد.

- - تمام موارد منفی تست یک ریسک باقی مانده (اگرچه خیلی کوچک) برای داشتن اختلالات کروموزومی دارند

سه انجمن ACOG، SMFM و ACMG توصیه نموده اند، که به تمام زنان باردار باید پیشنهاد انجام تست های تشخیصی (نظیر آمنیوسنتز و یا CVS) برای بررسی اختلالات آنوپلوئیدی صرف نظر از سن شان انجام شود.


توصیه های انجمن ACMG

- چه در بارداری تک قلویی و چه دوقلویی تست NIPT باید برای غربالگری خط اول اختلالات آنوپلوئیدی پیشنهاد بشود

که قدرت تشخیص بالایی برای:

- اختلالات کروموزومی شایع (تریزومی 21، 18 و 13) و اختلالات کروموزوم های جنسی دارد.

- سندرم دی جورج و یا میکرودیلیشن 22q11 دارد.

توجه: انجمن ژنتیک پزشکی آمریکا انجام غربالگری برای بررسی CNVs و تریزومی های اتوزومال نادر بدلیل عدم وجود شواهد کافی توصیه نمی کند.



.



.



توصیه مشترک ACOG/SMFM

- خط اول غربالگری اختلالات آنوپلوئیدی شامل تست NIPT و یا غربالگری سرمی سه ماهه اول به همراه و یا بدون انجام سونوی NT می باشد.

- هنوز غربالگری CNVs با توجه به نامشخص بودن قدرت تشخیص و مثبت کاذب غربالگری توصیه نمی شود.


نکات کلیدی در مشاوره قبل از تست

تست غربالگری سه ماهه اول

مزایا:

- یک تست ساده خون بین 11 تا 14 برای بررسی مارکرهای بیوشیمیایی

- اندازه گیری سونوی NT، به همراه تشخیص اختلالات ساختاری و جفت 

- قدرت تشخیص نسبتاً خوبی برای تریزومی 21 و 18 دارد.

محدودیت ها:

- قدرت تشخیص پایین نسبت به NIPT برای اختلالات آنوپلوئیدی شایع

- درصد مثبت کاذب حدود 5%

- فقط یک مورد از 20 مورد که جواب غربالگری مثبت دارند ، بچه مشکل اختلالات کروموزومی دارد و در نتیجه قسمت اعظم موارد مثبت غربالگری مشکلی نخواهند داشت.

- قدرت تشخیص بالایی برای اختلالات کروموزومهای وابسته به جنس ندارد.

- انجام سونوی NT نیازمند یک سونولوژیست متبحر و دستگاه سونوگرافی بسیار پیشرفته می باشد.

- نتایج در غربالگری بارداری های دوقلو قدرت تشخیص کمتری از بارداری های تک قلو دارد.


تست NIPT

مزایا

- انجمن ژنتیک پزشکی آمریکا (ACMG) این تست را مقدم بر غربالگری برپایه سرم می داند و توصیه به قرار گرفتن آن در صف اول غربالگری اختلالات آنوپلوئیدی می داند.

- می تواند از ابتدای هفته 9 ام هم انجام شود.

- قدرت تشخیص حدود 98.8% برای سندرم داون داشته و مثبت کاذب کمتر از 0.04% و برای کل اختلالات حدود 0.13%

- ارزش پیشگویی مثبت آن (Positive predictive value (PPV)) آن بالا بوده و موارد تایید جوابهای مثبت خیلی زیادتر از تست های غربالگری برپایه سرم است (91.8% در مقابل 3.6%)

- تنها تست غربالگری قابل دسترس برای موارد ذیل می باشد:

- جنسیت جنین و تعیین اختلالات آنوپلوئیدی وابسته به کروموزوم های جنسی

- سندرم های میکرودیلیشن

- تغییرات بزرگ ژنومی نظیر CNVs و سایر اختلالات آنوپلوئیدی


معایب

- بدلیل بالا بودن قدرت تشخیص و PPV ، سبب  سردرگمی بیماران شده که این یک تست تشخیصی است و نه غربالگری 

- درست است که اکثر جوابهای مثبت این تست یک مثبت حقیقی است ولی 100% نیست و باید برای تایید از تست های تشخیصی قطعی استفاده کنیم.

- ارزش پیشگویی کننده منفی آن (Negative predictive value (NPV)) برای اختلالات کروموزومی بسیار نادر است.

- تقریباً در یک درصد مواد هیچ جوابی (no call) دیده می شود و بیشتر در بیماران ذیل همراه است:

- - بیماران با BMI بالا

- - در معرض LMWH ها، نظیر انوکساپارین

- - اختلالات آنوپلوئیدی نظیر تریزومی 13 و 18

- گاهی اوقات با گزارش "ریسک بالا برای بدخیمی های مادری" مواجه می شویم که بدلیل سیگنال ناشی از اختلالات کروموزومی مترشحه از سلولهای بدخیم بوده و یا ممکن است ناشی از وجود یک موزائیسم در مادر باشد.



همینطور ACMG پیشنهاد می کند

- بهتر است برای اختلالات کروموزومی وابسته به جنس هم غربالگری انجام شود، زیرا:

- - بعضی از اختلالات کروموزومی وابسته به جنس نظیر سندرم ترنر ، ریسک بالایی برای داشتن ناهنجاری شکلی جنین می باشد و هشداری برای انجام اکوکاردیوگرام جنین می باشد.

- - تشخیص اولیه سندرم کلاین فلتر و شروع درمان از دوران کودکی می توانند سودمند باشد.


معایب:

- موارد مثبت کاذب بیشتری دارند.

توجه: جواب مثبت برای سندرم ترنر ممکن است نشان دهنده آن باشد که این قطعات مربوط به مادر است و نه جنین و در نتیجه هر جواب مشکوک به موزائیسم ترنر مادری باید به متخصص پریناتولوژی و یا ژنتیک ارجاع شود و فتال کاردیوگرافی برای پیگیری بیشتر انجام شود.



پیشنهاد دیگر ACMG

- غربالگری برای سندرم حذف 22q11.2 و یا سندرم دی جورج (که با اختلالات شکاف کام همراه است) 

- اختلال شایعی بوده و از هر 1 در 990 تا 1 در 2148 بارداری ها با توجه به جوامع مختلف درگیر می کند.

- این اختلال در زنان جوان شیوع بیشتری ، حتی از تریزومی 21 دارد.

- تشخیص این موارد ممکن است در بدو تولد از قلم بیفتد که در اینصورت والدین مجبور می شوند برای رسیدن به تشخیص  بیماری  مسیر پرپیچ و خم، طولانی، و طاقت فرسایی را طی نمایند.

- ارزش پیشگویی کننده مثبت آن (PPV) حدود 52.6% می باشد که خیلی بالاست، هرچند ممکن است مطالعات بیشتر در گروه کم خطر بدون داشتن هرگونه اختلال ساختاری پایین تر از این عدد باشد.

- ارزش پیشگویی کننده منفی آن هم بیشتر از 99% است.

معایب:

- مشابه سایر اختلالات ، نتیجه مثبت غربالگری نیاز به تست های تاییدی دارد.


غربالگری سایر اختلالات کروموزومی - CNVs

میکرودیلیشن های که بهتر است غربالگری شوند

نظیر: Prader Willi/Angelman Syndrome | Cri-du-chat | Wolf Hirshhorn syndrome


مزایا:

- بیماریهای هستند که میزان مرگ و میر و ناخوشی بالایی دارند.

- تست NIPT می تواند بعضی از این موارد را دیتکت کند.

معایب:

- توسط انجمن های ACOG و SMFM بدلیل قدرت تشخیص و میزان مثبت کاذب شان هنوز توصیه نشده است.

- برای بررسی این موارد باید درخواست Chromosomal MicroArray -MCA در مایع آمنیون و یا CVS انجام شود.

- بدلیل شیوع پایین این بیماریها PPV پایینی دارند.

- حتماً موارد مثبت در تست NIPT برای بررسی بیشتر باید ابتدا مشاوره ژنتیک برایشان در نظر گرفته شود که با سابقه خانوادگی بیمار تطبیق داده شود.


غربالگری برای تغییرات Genome-wide

مزایا

- تغییرات کروموزومی را در سراسر ژنوم تجزیه و تحلیل می کند

- آنوپلوئیدی های اتوزومال نادر با حوادث نامطلوب بارداری مرتبط بوده اند، اگرچه در حال حاضر راهی برای پیش بینی نتایج دقیق بارداری وجود ندارد.

نگرانی ها

- یافته های اتقاقی در Genome wide cfDNA نسبت به   Targeted cfDNA خیلی بیشتر است که منجر به نگرانی بیشتر زنان باردار می شود.

- برای مشاوره به بیماران ضروری است که گفته شود که  Genome wide cfDNA می تواند نسبت به یافته‌های بالینی قابل اهمیتی که با آزمایش‌های تشخیصی تهاجمی با استفاده از میکرواری بدست می دهد، را از دست بدهد.

- به طور کلی غربالگری کل ژنوم برای CNV های اضافی و تریزومی های اتوزومی نادر توسط سازمان های حرفه ای برای غربالگری معمول توصیه نمی شود.


مشاوره پس از آزمون - نکات کلیدی

نتیجه غربالگری مثبت

احتمال اینکه گزارش مثبت یک مثبت واقعی باشد چقدر است؟

- در واقع PPV مشخصه عملکرد حیاتی برای مشاوره پس از آزمون است و به احتمال اینکه گزارش cfDNA مثبت بیمار واقعاً با یک تشخیص قطعی مرتبط باشد اشاره دارد.

برای T21: PPV 91.8٪

و برای T18: PPV 65.8٪ و    T13: PPV 37.2٪ می باشد.

- علت اعداد کمتر برای  T18 و T13 به دلیل شیوع کمتر آنها می باشد.

- برای مشاوره در مورد PPV برای آنیوپلوئیدی خاص که در آن گزارش مثبت است، باید دقت شود که:

- - میزان PPV بر اساس سن مادر و خطر پیش بینی بر اساس وجود یا عدم وجود یافته های سونوگرافی تغییر می کند



چه چیزی می تواند باعث مثبت کاذب شود؟

- احتمال مثبت کاذب برای T21  کمتر وجود دارد اما ممکن است رخ دهد 

- این مسئله در T18 و T13 رایجتر است


علل بیولوژیکی شامل

- موزائیسم (مخلوط رده های سلولی غیر طبیعی و عادی) 

- موزاییک جفت محدود می تواند منجر به نتیجه مثبت کاذب شود زیرا cfDNA قطعات DNA جفت را تجزیه و تحلیل می کند.

- دوقلو ناپدید شدن | احتمال آنوپلوئید بیشتر است و سلول های غیر طبیعی باقیمانده ممکن است در جفت باقی بمانند

- بدخیمی مادر 

- ناهنجاری کروموزومی مادر


مراحل بعدی پس از یک نتیجه مثبت چیست؟

سونوگرافی دقیق (از جمله اکوکاردیوگرافی جنین) و خدمات مشاوره ژنتیک را توصیه کنید

نکته کلیدی: نتیجه را با آزمایش تشخیصی تایید کنید

- به بیمار CVS و یا آمنیوسنتز پیشنهاد شود.

- اگر cfDNA برای T13 یا سندرم ترنر مثبت است و به خصوص اگر سونوگرافی طبیعی به نظر می رسد، با توجه به خطر بالای CPM، آمنیوسنتز را به شدت نسبت به CVS در ارجعیت است.

- برای تأیید میکرودیلیشن ها نیاز به میکرواری است و اگر تنها آمنیوسنتز با کاریوتایپ استاندارد انجام شود، تشخیص داده نمی شوند

- ممکن است بر اساس اختلال خاصی که در غربالگری تشخیص داده شده است، آزمایش مولکولی اضافی مورد نیاز باشد

- در صورت رد شدن آزمایش، مدیریت بر اساس ویژگی های سونوگرافی و خواسته های بیمار انجام می شود

- سونوگرافی های سریال برای برنامه مراقبت انجام شود

- بعد از تولد کاریوتایپ نوزاد با آزمایشات اضافی مانند میکرواری و تست مولکولی بسته به نوع اختلال انجام شود.


نتیجه غربالگری منفی

احتمال اینکه گزارش منفی یک منفی واقعی باشد چقدر است؟

- میزان NPV، که نشان می دهد یک گزارش منفی واقعاً منفی است، > 99٪ است.

چه چیزی می تواند باعث منفی کاذب شود؟

توضیحات احتمالی برای نتیجه آزمایش منفی کاذب در تست NIPT

- خطای برچسب زدن نمونه

- فتال فراکشن پایین قطعات cfDNA

- احتمال موزاییکی که در سطوح پایین در جفت وجود دارد و مشخص نمی شود.

- احتمال موزائیک در جنین (True fetal mosaeisms)


مراحل بعدی پس از یک نتیجه منفی چیست؟

- با گزارش منفی غربالگری می توان به بیمار اطمینان داد، اما باید توجه داشته باشد که همیشه یک خطر باقیمانده با هر آزمایش غربالگری وجود دارد.

- هنوز ممکن است آزمایش تهاجمی را انتخاب کند، به ویژه اگر یافته ای غیرطبیعی در اولتراسوند مشاهده شود.

- اگر ناهنجاری های مادرزادی در سونوگرافی یافت شود، cfDNA نباید بعنوان یک اقدام کافی در نظر گرفته شود

در این مواقع:

- - آزمایش تهاجمی باید ارائه شود

- - سایر ناهنجاری‌های کروموزومی ممکن است با روش میکرواری شناسایی شوند.


مراحل بعدی پس از عدم پاسخ در تست NIPT و یا نتیجه «No Call»


- مهمترین علت این مسئله کاهش فتال فراکشن می باشد

- افزایش خطر آنوپلوئیدی با این یافته، به ویژه T18، T13 و SCAs (احتمالاً به دلیل جفت کوچکتر) زیاد است.

- فقط در صورتی تکرار کنید که GA اولیه ممکن است خیلی زود بوده و نتیجه را دچار مشکل کند (بعبارتی اگر تست کمتر از 10 الی 12 هفته انجام شد می توان تست را تکرار کرد)

- آزمایش قطعی و سونوگرافی اولیه را ارائه دهید



مراحل بعدی پس از "خطر بدخیمی مادر"

- گاهی چنین گزارشی ممکن است با خطر بدخیمی مادر به دلیل چندین سیگنال انحراف کروموزومی شناسایی شده در cfDNA داده شود.

- در حال حاضر، هیچ دستورالعمل حرفه ای استاندارد شده ای برای مراحل بعدی پس از یک نتیجه cfDNA وجود ندارد که نشان دهنده بدخیمی احتمالی مادر باشد، وجود ندارد.

- کار پیشنهادی برای بدخیمی شامل در نظر گرفتن موارد زیر است:

- 
- تمایل بیمار به اطلاعات بیشتر در این زمینه

- هزینه های بررسی بیشتر

- تاریخچه شخصی و سابقه خانوادگی خود بیمار


پیگیری بیشتر می تواند شامل:

- شرح حال دقیق پزشکی 

- معاینه جامع فیزیکی 

- انجام آزمایشات و  تصویربرداری مورد نیاز

- ارجاع به متخصص انکولوژی نیز باید در نظر گرفته شود


- اگر آنوپلوئیدهای متعدد یا غیرمعمول تشخیص داده شد که نشان دهنده بدخیمی نیستند، همچنان باید به ژنتیک و یا متخصص پریناتولوژی ارجاع داده شود.



نکات کلیدی (Key points):

- بررسی قطعات cfDNA از توالی یابی نسل بعدی برای بررسی قطعات DNA در مادر و جنین برای تعیین احتمال برخی شرایط ژنتیکی در جنین استفاده می کند.

- در حالی که چندین پانل در دسترس وجود دارد، در مورد کاربرد بالینی غربالگری cfDNA برای T13، T18 و T21 اتفاق نظر وجود دارد.

- آموزش به بیمار، به ویژه در مورد مفهوم ارزش اخباری مثبت (PPV) در اولویت قرار دارد

- فراتر از آنئوپلوئیدی های رایج، از cfDNA نیز می توان برای غربالگری موارد ذیل استفاده کرد:

- - آنوپلوئیدی کروموزوم جنسی 

- - بررسی CNVs در سراسر ژنوم 

- - بررسی میکرودیلیشن های انتخابی و شایعتر

- مشاوره بیماران در مورد این نتایج می تواند متفاوت باشد

- نتیجه افزایش خطر بدخیمی مادر نیز می تواند در طول آزمایش با cfDNA مشخص شود

- توانایی ارائه دهنده برای انجام مشاوره پیش از انجام تست  و پس از انجام تست برای ارائه تست ضروری است

- اگر  تست cfDNA منفی باشد دیگر نیازی به انجام سونوی NT وجود ندارد.

- سونوگرافی سه ماهه دوم بارداری باید برای همه زنان باردار مستقل از cfDNA ارائه شود تا ناهنجاری های ساختاری را ارزیابی کنند.

- همه جوامع حرفه ای تاکید می کنند که تصمیمات بالینی باید بر اساس نتایج آزمایش های تشخیصی تاییدی باشد و نه بر اساس نتایج غربالگری، به ویژه ختم بارداری.

- کاریوتایپ استاندارد روی نمونه CVS یا آمنیوسنتز ممکن است برای تایید کافی نباشد

- تأیید میکرودیلیشن ها به دلیل اندازه کوچک توالی حذف شده نیاز به تجزیه و تحلیل دقیق میکرواری دارد

- برخی از سندروم‌های میکرودیلیلشن ممکن است نیاز به آزمایش تخصصی برای دیزومی تک‌والدینی ( uniparental disomy) داشته باشند که می‌تواند تشخیص دهد که منشأ توالی گم‌شده مادری است یا پدری.